物联网软件开发公司 Cell Reports Medicine | METTL3驱动NAFLD相关的肝细胞癌，是促进免疫调养的调养靶点
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算计布景
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指一种由非酒精摄入所致的肝脏内异位脂肪千里积所界说的肝病。在好多发达国度，NAFLD的发病率马上飞腾，并马上成为肝细胞癌(HCC)的要紧病因。与病毒相关的HCC比较，NAFLD-HCC阐扬出代谢重编程、肝脂积存和脂毒性驱动的慢性炎症等特征，这些特征影响NAFLD-HCC的调养反映性。免疫查验点阻断(ICB)调养，如抗方法化细胞弃世卵白1 (PD-1)/方法化弃世配体1 (PD-L1)抗体，还是透顶转换了病毒相关HCC的责罚。与此同期，临床前算计标明，ICB调养小鼠可通过组织内自体侵袭性CD8 TNF PD-1 T细胞的特别从头激活，从而加快NAFLD-HCC的进展，疏浚肝损害、肝硬化和最终的肿瘤发生。因此，要紧需要细则NAFLD-HCC肿瘤免疫微环境的影响要素，并将其行动促进ICB调养的靶点。
表不雅转录组学包括大齐的RNA修饰，通过调控RNA踏实性、剪接、转运和翻译，对卵白质翻译的转录后调整至关要紧。表不雅转录组的破裂是癌细胞的一个记号。RNA N6-methylladenosine (m6A)是由writers(METTL3/METTL14/WTAP)、erasers (FTO/ALKBH5)和reader(YTHDF1-3/YTHDC1-2)动态调控，它们分辨催化m6A的甲基化和去甲基化，并识别m6A修饰的RNA。最近的责任还是揭示了m6A调控因子在癌症中施展多方面的作用，包括细胞滋长，自我更新/干性，和移动。除了肿瘤的内在作用外，m6A修饰也被讲明不错调整抗肿瘤免疫然而，m6A是否调整以及奈何调整NAFLD-HCC尚不昭着。为了细则NAFLD-HCC的调养靶点，咱们对NAFLD-HCC转录组测序和基因要道数据集进行了整合分析，揭示了m6A writer METTL3行动NAFLD-HCC的潜在调养靶点。
在本算计中，咱们讹诈肝特异性METTL3基因敲入小鼠和METTL3基因敲除小鼠算计了METTL3在NAFLD-HCC进展中的致癌作用。咱们破解了METTL3的作用机制，包括m6A修饰的SREBP裂解激活卵白(SCAP)，它促进胆固醇的生物合成，进而损害NAFLD-HCC中细胞毒性CD8 T细胞。在NAFLD-HCC中，靶向METTL3可激活CD8 T细胞介导的抗肿瘤反映并逆转抗PD-1耐药性。因此，METTL3是改善NAFLD-HCC抗PD-1调养成果的调养靶点。
算计收尾
1. 整合转录组和CRISPR-Cas9筛选发现METTL3是NAFLD-HCC的要紧基因。
咱们凭据两个表率筛选了NAFLD-HCC中可用药的候选基因:(1)在NAFLD-HCC中过抒发，(2)对NAFLD-HCC细胞糊口至关要紧。为此，咱们查询了17对NAFLD-HCC和左近非肿瘤组织的里面RNA测序(RNA-seq)数据库，发咫尺NAFLD-HCC中过抒发的基因有2,028个， METTL3是候选基因中RNA修饰量最高的基因之一(图1A)。接下来，咱们在NAFLD-HCC细胞中进行CRISPR-Cas9 dropout筛选，以识别NAFLD-HCC中的要道基因(图1B)。咱们的Epi-Drug文库由来自东说念主类基因组的1332个可用药基因构成共有76个要道基因被武断为NAFLD-HCC细胞存活的要道基因 (图1B和S1A)。这些数据集的一样规模缩小到22个常见的候选基因(图S1A)，其中METTL3是排行最高的候选基因(图1B)。METTL3是主要的m6A甲基移动酶，催化mRNA的m6A修饰。在所有m6A调整因子中，只须METTL3在NAFLD-HCC中显贵上调(图S1B)。一致的是，与相邻的普通组织比较，在东说念主类NAFLD-HCC组织中，以及与普通小鼠肝脏组织比较，在NAFLD-HCC小鼠组织中，在卵白水平上不雅察到更高的METTL3抒发(图1C)。
接下来，咱们考据了METTL3的体外功能。咱们对内源性高抒发METTL3的HKCI2细胞进行了METTL3敲除，而对内源性低抒发METTL3的HKCI10细胞进行了METTL3过抒发(图S1D)。与METTL3的m6A writer功能一致，dot blot收尾披露，在东说念主NAFLD-HCC细胞系HKCI2细胞中，敲除METTL3可缩短RNA m6A;相悖，METTL3的异位抒发加多了NAFLD-HCC细胞系HKCI10细胞中m6A的品貌(图1D和S1E)。在HKCI2细胞中，敲低METTL3扼制细胞滋长(图1E)，疏浚细胞周期G1期防碍(图1G)，并加多细胞凋一火(图1H)。相悖，在HKCI10细胞中过抒发METTL3会产生相悖的成果(图1F和S1F)。因此，咱们细则METTL3在NAFLD-HCC中是一个要紧的过抒发基因。
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图1. METTL33在NAFLD-HCC中过抒发，对NAFLD-HCC细胞糊口至关要紧。
(A) RNA-seq披露17对NAFLD-HCC及相邻普通组织中各异抒发基因的火山图。RNA修饰基因被符号为红色圆圈(左)。在NAFLD-HCC中，METTL3的抒发被显贵疏浚(右)。
(B) CRISPR-Cas9筛选经由(左)。通过Epi-Drug库CRISPR-Cas9筛选，METTL3是NAFLD-HCC细胞(HKCI2)的首选候选细胞(右)。
(C)在一个落寞部队中考据了东说念主NAFLD-HCC中METTL3的卵白抒发(n = 10)。
(D)点思绪定量抒发shMETTL3或shNC的HKCI2细胞和过抒发METTL3的HKCI10细胞的mRNA转录本中m6A品貌。亚甲基蓝(MB)行动负载对照。ShNC, shControl;shMETTL3, METTL3击倒。
(E) western blot阐发HKCI2细胞中METTL3基因敲除。敲除METTL3可扼制细胞增殖和菌落造成。
(F) western blot阐发HKCI10细胞中METTL3过抒发。METTL3过抒发促进HKCI10细胞滋长和集落造成。
(G)通过碘化丙啶(PI)染色和流式细胞仪检测，METTL3下调疏浚G1期细胞周期防碍。
(H)通过annexin v -藻红卵白/7-AAD染色和流式细胞术检测，METTL3下调疏浚细胞凋一火。
2. 肝细胞特异性METTL3敲入加剧小鼠NAFLD-HCC。
为了算计METTL3在NAFLD-HCC中的作用，咱们通过将METTL3全长编码序列(CDS)插入到Rosa26位点(Rosa26lsl-Mettl3)构建了条款敲入小鼠(图2A)。将Rosa26-lsl-Mettl3小鼠与cre小鼠杂交，产生肝细胞特异性Mettl3敲入小鼠(Mettl3LKI)(图2A和S2A)。用二乙基亚硝胺(DEN)打针Mettl3LKI小鼠特别野生型同胎小鼠，再加胆碱缺少、高脂肪饮食(CDHFD)疏浚NAFLD-HCC(图2B)。咱们进行了磁共振成像(MRI)(图2C)和血清甲胎卵白(AFP，肝癌的符号物)检测(图2D)，这两项齐推断了Mettl3LKI小鼠肝脏肿瘤的加快发生。此外，Mettl3LKI小鼠血清胆固醇、甘油三酯(TG)、天冬氨酸转氨酶(AST)显贵升高(图2E)，领导高脂血症加剧，肝脏损害加剧。在葬送实验中，咱们不雅察到与野生型小鼠比较，Mettl3LKI小鼠的肝脏肿瘤数目(p = 0.006)和肿瘤大小(p < 0.001)显贵加多(图2F、S2B和S2C)。组织学评估(H&E)阐发在Mettl3LKI小鼠中NAFLD-HCC造成加多(图2F)。接下来咱们进行Ki-67染色以评估细胞增殖。与野生型小鼠比较，Mettl3LKI小鼠的细胞增殖增强(图2G)。为了落寞考据METTL3在NAFLD-HCC中的致癌作用，咱们将Mettl3LKI小鼠和野生型同鼠置于DEN加高脂肪、高胆固醇饮食(HFHCD)下(图2H)。收尾一致，披露Mettl3LKI小鼠具有更高的血清AFP（图2 I），加多的血清胆固醇、甘油三酯和AST水平（图2 J），况且发展出更多的具有更大尺寸的肝肿瘤（图2K和S2 D）。Ki-67染色揭示了Mettl3LKI小鼠的肝肿瘤中细胞增殖的一致加多（图2L）。同期，赐与普通食品饮食的Mettl3LKI小鼠和它们的野生型对应物讲明在肝组织学和肝功能记号物（AST、丙氨酸氨基移动酶[ALT]、TG和胆固醇）方面莫得各异（图S2 E-S2 G）。总的来说，这些收尾讲明小鼠中的肝细胞特异性Mettl3敲入通过促进高脂血症和细胞增殖来加快饮食疏浚的NAFLD-HCC。
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图2. 肝细胞特异性METTL3敲入加快饮食疏浚的NAFLD-HCC。
(A)肝细胞特异性Mettl3敲除小鼠(Mettl3LKI)的筹备。Western blot阐发METTL3在Mettl3LKI小鼠肝脏中过抒发。
(B)二乙基亚硝胺(DEN)打针和CDHFD疏浚的NAFLD-HCC的实验筹备。14日龄时，将野生型(WT)或Mettl3LKI小鼠单次打针DEN (5 mg/kg)。从6周龄驱动，小鼠被喂食CDHFD直到第27周。
(C) WT和Mettl3LKI小鼠NAFLD-HCC肿瘤的MRI。
(D) WT和Mettl3LKI小鼠血清AFP水平。
(E)肝细胞特异性METTL3过抒发加多了血清胆固醇、TG和AST水平。
(F)CDHFD疏浚的WT和Mettl3LKI小鼠中具有代表性的大体形态、H&E染色、名义肿瘤数目和肿瘤大小(n = 10/组)。
(G) WT和Mettl3LKI小鼠肝脏Ki-67染色。
(H)打针DEN和HFHCD疏浚的NAFLD-HCC的实验筹备。14日龄时，赐与WT或Mettl3LKI小鼠单次打针DEN (5 mg/kg)。从6周龄驱动，小鼠被喂食HFHCD，直到第27周。
(I)肝细胞特异性Mettl3LKI升高血清AFP。
(J) HFHCD处理后WT和Mettl3LKI小鼠血清胆固醇、TG和AST水平。
(K) Mettl3LKI促进HFHCD疏浚的NAFLD-HCC，从肿瘤数目、肿瘤大小和H&E染色可见(n = 7/组)。
(L) WT和Mettl3LKI小鼠肝脏Ki-67染色。
3. METTL3敲除可扼制小鼠NAFLD-HCC的造成。
为了考据METTL3在NAFLD-HCC中的作用，咱们接下来建筑了METTL3杂合敲除(Mettl3 /-)小鼠(图3A)，该小鼠不影响CD8 T细胞的增殖和功能(图S3A-S3E)。将Mettl3 /-小鼠和野生型同窝小鼠赐与DEN HFHCD疏浚NAFLD-HCC(图3B)。打针DEN后21周，与野生型小鼠比较，Mettl3 /-小鼠血清AFP水平缩短(图3C)。与野生型小鼠比较，Mettl3 /-小鼠的肝脏肿瘤数目(p = 0.048)和大小(p = 0.010)更小(图3D和S3F)。与野生型对照组比较，HFHCD处理的Mettl3 /-小鼠的血清胆固醇(p = 0.013)和ALT (p = 0.043)缩短(图3E)。DEN HFHCD加多野生型小鼠肝脏细胞增殖，而Mettl3 /-小鼠肝脏细胞增殖彰着减轻(p < 0.001)(图3F)。此外，咱们通过喂食HFHCD小鼠45周，建筑了NAFLD-HCC自愿模子(图3G)一致地，METTL3基因敲除扼制了NAFLD-HCC的发展，AFP和MRI测量值缩短(图3G)，肿瘤数目(p = 0.019)和大小(p = 0.042)减少(图3H和S3G)。与之一致的是，Mettl3 /-小鼠的细胞增殖也减少了(图3I)。咱们的数据标明，METTL3的敲除可能防止NAFLD-HCC的发展，是一个潜在的调养靶点。
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图3. METTL3敲除可扼制饮食疏浚的NAFLD-HCC。
(A) Western blot阐发在Mettl3 /-小鼠肝脏中敲除METTL3。
(B)实验筹备:在第14天单剂量使用DEN (25 mg/kg)加普通饮食(ND)行动对照组，或在第6周驱动使用DEN (25 mg/kg)加HFHCD疏浚NAFLD-HCC。
(C) WT或Mettl3 /-喂食ND或HFHCD的小鼠血清AFP水平。
(D) WT或Mettl3 /-小鼠肝脏中具有代表性的大体形态、H&E染色、肿瘤数目和肿瘤大小(n = 6-8 /组)。
(E) METTL3敲除扼制血清胆固醇和ALT。
(F) WT或Mettl3 /-小鼠肝脏Ki-67染色。
(G) HFHCD疏浚的自愿性NAFLD-HCC的实验筹备。MRI和血清AFP监测肿瘤造成情况。
(H)凭据H&E染色、肿瘤数目和肿瘤大小，敲除METTL3可减少肿瘤造成(n = 6-7 /组)。
(I)经WT和Mettl3 /-小鼠喂养的HFHCD肝脏Ki-67染色。
4. 肝细胞特异性METTL3敲入缩短NAFLD-HCC的抗肿瘤免疫功能。
为了揭示Mettl3疏浚的NAFLD-HCC的分子机制，咱们对Mettl3LKI和野生型小鼠的NAFLD-HCC肿瘤组织进行了RNA测序。值得看重的是，通过基因组富集分析(GSEA)，免疫相关通路，如细胞因子-细胞因子受体相互作用、原发性免疫劣势和趋化因子信号通路在Mettl3LKI肿瘤中显贵下调(图4A和S4A)。这标明在NAFLD-HCC中，肝细胞特异性METTL3敲入可重塑免疫微环境。在此布景下，咱们对Mettl3LKI小鼠和野生型对照小鼠肝脏肿瘤中的CD45 细胞群进行了单细胞RNA-seq (scRNA-seq)检测(图4B)。非监督t-散播式随即邻居镶嵌(t-SNE)识别不同的免疫细胞群，包括B细胞(Cd19 Cd79 )、树突状细胞(Cdllc Lv6c2 )、Kupffer细胞(F4/80 Csflr )、巨噬细胞(Mrcl )、骨髓源性扼制细胞(Ly6g S100a8 S100a9 )、当然杀伤(NK)/当然杀伤T细胞(NKT) (Klrblc Ncrl )和T细胞(kirblc trbcl )(图4C)。其中，Mettl3LKI小鼠的T细胞簇彰着减少(p < 0.001)， NK细胞下调，而Kupffer细胞和B细胞呈加多趋势(图4C)。这意味着肝细胞特异性METTL3可能在NAFLD-HCC中调整T细胞活性。接下来咱们将T细胞和NK细胞群分红8个簇(图4D, 4E，和S4B)。值得看重的是，在Mettl3LKI小鼠中，GZMB 和阻挠素γ -阳性(IFN-g ) CD8 T细胞(簇0和4)的浸润减少，标明肝细胞特异性Mettl3敲入扼制NAFLDHCC细胞毒性CD8 T激活(图4F和4G)。
为昭着解减轻CD8 T细胞效应表型赢得的分子机制，咱们还进行了GSEA查询Hallmark数据库。肿瘤固有的METTL3敲入卵白显贵增强了CD8 T细胞功能空乏的要道通路的抒发，如胆固醇代谢、铁细胞凋一火、统一体和溶酶体(图4H)。与此一致的是，流式细胞术披露Mettl3LKI小鼠CD3 和CD8 细胞亚群中总T细胞(CD3 )(图4I)和激活记号物IFN-g和GZMB的抒发均减少(图4J)。与对照组小鼠比较，Mettl3LKI小鼠血清IFN-g水平缩短，阐发了T细胞功能受损(图4K)。此外，在咱们的Mettl3LKI小鼠肿瘤中，CD8 PD-1 T细胞抒发上调，这意味着METTL3扼制了T细胞效应因子功能，促进了T细胞衰退(图S4C和S4D)。其他免疫细胞类型，如CD4 T细胞、调整性T细胞(Treg)或NK细胞，莫得显贵各异(图S4E-S4G)。所有这些数据使咱们提倡疑问，Mettl3介导的NAFLD-HCC是否依赖于其对CD8 T细胞的作用。为此，咱们在原位NAFLD-HCC模子中进行了CD8 T细胞蹧跶(图4L、S4H和S4I)。将抒发Hepal-6-luc的对照组(sgNC)或敲除METTL3的对照组(sgMETL3)植入C57BL/6小鼠的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝脏，随后用抗CD8α或免疫球卵白(Ig) G对照组调养。如图4M所示，云南物联网软件开发在IgG对照组中，去除METTL3显贵扼制了原位NAFLD-HCC的滋长，而在抗CD8α去除CD8 T细胞后，这种扼制作用隐藏。咱们的收尾标明，肿瘤固有的METTL3通过减轻微胞毒性CD8 T细胞反映促进NAFLD-HCC。
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图4. NAFLD-HCC肿瘤内源性METTL3限度CD8 T细胞的激活和效应气象。
(A)在Mettl3LKI小鼠NAFLD-HCC中，RNA-seq下调了免疫粗疏相关通路。
(B)单细胞RNA-seq及下贱分析暗意图。
(C)识别肿瘤浸润免疫细胞群。肿瘤浸润免疫细胞的单细胞RNA测序(scRNA-seq)披露，Mettl3LKI小鼠的T细胞已耗尽。
(D)不同肿瘤浸润T/ NK细胞群的基因符号物。
(E)肿瘤浸润T/ NK细胞群的武断。
(F) IFN-g和GZMB在肿瘤浸润T/ NK细胞中的散播和抒发。
(G)不同CD8 T细胞群的比例(G1)，以及披露WT和Mettl3LKI CD8 T细胞中IFN-g和GZMB抒发的小提琴图(G2)。
(H) Mettl3LKI小鼠和WT小鼠肿瘤中CD8 T细胞各异抒发基因的GSEA。
(I)流式细胞术考据CD3 T细胞浸润特别激活记号物IFN-g和GZMB在WT和Mettl3LKI小鼠肿瘤中的抒发。
最近100期开奖中，含有重号的奖号有64期，最近20期含有重号的奖号有12期，最近10期含有重号的奖号有5期。本期注意重号落号。
软件开发(J)流式细胞术检测IFN-g 和GZMB CD8 T细胞在WT和Mettl3LKI小鼠肿瘤中的浸润。
(K)与WT小鼠比较，Mettl3LKI小鼠血清IFN-g水平缩短。
(L)原位NAFLD-HCC模子中抗CD8α蹧跶机制暗意图。
(M)经IgG或抗PD -1调养的原位NAFLD-HCC肿瘤在肝内打针后21天的肝脏代表性图像。原位NAFLD-HCC小鼠的肿瘤分量和体积定量(n = 7-9 /组)。
5.METTL3促进NAFLD-HCC细胞胆固醇的生物合成。
为了深切了解在NAFLD-HCC细胞中被METTL3阻挠的分子事件，咱们对敲除或不敲除METTL3的HKCI2细胞进行了整合RNA-seq和m6A测序(m6A-seq)。在METTL3敲除细胞中，共有149个基因下调，192个基因上调 (图S5A)。各异抒发基因的道路富集披露胆固醇生物合成是最富集的道路(图5A)。火山图披露，METTL3基因敲除细胞中胆固醇生物合成的主转录因子SREBP2，以及甲戊酸道路中的酶(HMGCS1、HMGCR、MVK、FDFTI和SQLE)和远端胆固醇生物合成(LSS、DHCR7和DHCR24)下调(图5B，左，和S5B)。GSEA也披露了METTL3基因敲除细胞中胆固醇生物合成的显贵蹧跶(图5B，右)。Western blot阐发，在HKCI2细胞中敲低METTL3不错扼制HMGCR、SQLE和SREBP2卵白的抒发，这是胆固醇生物合成中的要道限速酶(图5C和S5C)。相应地，shMETTL3在HKCI2细胞中缩短了游离胆固醇和胆固醇酯(图5C)。相悖，在HKCI10细胞中过抒发METTL3可促进HMGCR、SQLE和SREBP2的抒发，并疏浚细胞胆固醇水平(图5D和S5C)。与体外算计收尾一致，Mettl3LKI小鼠肝脏胆固醇和胆固醇酯水平升高(图5E)，而Mettl3 /-小鼠肝脏胆固醇和胆固醇酯水平下调(图5F)。在咱们的东说念主NAFLD-HCC部队中，METTL3 mRNA抒发与HMGCR、SQLE和SREBP2 mRNA呈正相关(图5G和S5D)。因此，咱们的数据标明，METTL3可能驱动NAFLD-HCC中特别的胆固醇生物合成。
6.SCAP是METTL3促进胆固醇生物合成的要道靶点。
接下来，咱们检会了METTL3介导的m6A是否通过m6A-seq在METTL3敲低的HKCI2细胞中对胆固醇生物合成道路进行了积极调控(图S5E)。METTL3耗竭主要下调CDS和3’ UTR中的m6A峰值(图5H)。总的来说，与对照组(N = 8894)比较，METTL3的下调显贵减少了m6A峰值(N = 5,563)(图S5F)。咱们将METTL3的潜在m6A靶点与胆固醇合成道路一样，揭示了一个共同的基因SCAP(图5I)。SCAP 14个m6A-seq序列的UCSC片断披露Mettl3扼制的m6A被下调(图5J)。SCAP mRNA的修饰被甲基化RNA免疫千里淀(MeRIP)-qPCR阐发(图5J和S5G)。相悖，Metttl3过抒发加多了SCAP的m6A修饰(图5J)。此外，核糖体测序(Ribo-seq)和核糖体重生链复合体市欢mRNA-qPCR (RNC-qPCR)均披露METTL3介导的m6A加多了SCAP的翻译(图5K)。为舒适METTL3介导的SCAP的径直作用，接收抗METTL3抗体的RNA免疫千里淀(RIP)-qPCR方法。咱们发现与IgG对照比较，METTL3 pull down导致SCAP mRNA的富集(图5L)。一致地，METTL3敲低撤销了SCAP mRNA的富集(图5L)，阐发了其与SCAP mRNA的径直市欢。然后，咱们将SCAP 3’ UTR插入萤火虫荧光素酶基因的下贱，生成了一个荧光素酶回报基因。shMETTL3或METTL3扼制剂STM2457均显贵缩短了SCAP 3’ UTR荧光素酶回报酶活性(图5M)，标明METTL3扼制扼制了SCAP的转译。扶持这一不雅点的是，shMETTL3扼制HKCI2细胞中SCAP卵白的水平，而Metttl3过抒发在HKCI10细胞中具有相悖的作用(图5N)，而不影响SCAP mRNA(图S5H)。值得看重的是，催化失活的突变体METTL3未能促进SCAP卵白的抒发(图5O)，这意味着METTL3以依赖m6A的方式促进SCAP的翻译。与体外不雅察收尾一致，与对照组小鼠比较，METTL3LKI小鼠肿瘤中SCAP卵白(而非其mRNA)抒发上调(图5P和S5I)。此外，在配对的NAFLD-HCC组织中，SCAP和METTL3卵白抒发之间存在正相关(N = 10, p < 0.001)(图5Q和S5J)。为了武断METTL3疏浚的SCAP翻译中触及的m6A readers，咱们在METTL3过抒发的NAFLD-HCC细胞中进行了m6A readers (YTHD1/2/3、YTHDC1/2和IG2BP1/2/3)的敲除(图S5K)。在m6A readers中，YTHDC1基因敲低显贵扼制了SCAP卵白的抒发(图S5K)。一致地，siYTHDC1减少了SCAP 30 UTR回报器的活动(图S5L)。RIP-qPCR检测阐发了YTHDC1与SCAP mRNA的径直市欢，而这种市欢在METTL3过抒发后增强(图S5M)。接下来，咱们问SCAP是否参与了METTL3介导的胆固醇生物合成。事实上，siSCAP撤销了HKCI10细胞中METTL3过抒发对胆固醇的疏浚作用(图5R)。siSCAP或siMETTL3缩短了胆固醇生物合成基因的抒发和细胞外胆固醇水平(图S5N和S5O)。总之，咱们的算计收尾标明，SCAP在NAFLD-HCC中是METTL3促进胆固醇生物合成的下贱靶点。
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图5. METTL3通过m6A修饰SCAP促进胆固醇的生物合成。
(A和B) RNA测序披露，在HKCI2细胞中敲低METTL3可缩短胆固醇的生物合成。
(C) HMGCR和SQLE卵白在HKCI2细胞中被shMETTL3扼制。(左)。HKCI2-shMETTL3细胞中总游离胆固醇和酯减少(右)。
(D) METTL3过抒发疏浚HKCI10细胞HMGCR和SQLE卵白抒发，以及胆固醇和胆固醇酯水平。
(E) WT和Mettl3LKI小鼠饮食疏浚的NAFLD-HCC的肝脏胆固醇和胆固醇酯水平。
(F) WT和Mettl3 /-饮食疏浚的NAFLD-HCC小鼠的肝脏胆固醇和胆固醇酯水平。
(G)东说念主NAFLD-HCC中METTL3与胆固醇合成基因的相关性。
(H) m6A-seq在METTL3敲除或不敲除的HKCI2细胞中识别出的总体m6A谱。m6A峰和识别出的m6A基序的表率化散播。
(I) m6A耗竭峰值与胆固醇代谢一样，标明SCAP是METTL3的靶点。
(J) SCAP mRNA m6A-seq序列的UCSC快照(左)。归一化的读密度等第用灰色(shNC)或蓝色(shMETTL3)暴露。MeRIP-qPCR检测m6A在METTL3敲低的HKCI2细胞和METTL3过抒发的HKCI10细胞中SCAP mRNA水平。
(K) Ribo-seq披露HKCI2中METTL3敲低时SCAP翻译受到扼制(左)。hci2细胞中METTL3基因敲低的SCAP(中)和hci10细胞中METTL3过抒发的SCAP(右)。
(L) HKCI2细胞METTL3-RIP-qPCR暗意图(左)。METTL3在HKCI2细胞中对SCAP RNA的相对富集(中)。通过METTL3- rip - qpcr在HKCI2中敲除METTL3后SCAP的相对富集(右)。
(M)经METTL3敲除后的HKCI2细胞SCAP 30 UTR的荧光素酶活性(左)或经METTL3扼制剂STM2457处理后的HKCI2细胞的荧光素酶活性(右)相关于Renilla荧光素酶活性。
(N)在METTL3敲低的HKCI2细胞和过抒发METTL3的HKCI10细胞中SCAP卵白的抒发。
(O)突变体METTL3未能促进SCAP、HMGCR和SQLE卵白的抒发。
(P) WT和METTL3LKI在饮食疏浚的NAFLD-HCC中的SCAP卵白抒发。
(Q)通过western blot和密度分析细则东说念主NAFLD-HCC中SCAP和METTL3卵白水平的相关性。
(R) western blot检测HKCI10细胞中SCAP基因的抒发(左)。siSCAP逆转了mettl3疏浚的胆固醇水平(右)。
7.肿瘤固有的METTL3通过胆固醇生物合成损害CD8 T细胞功能。
胆固醇在肿瘤微环境中可疏浚CD8 细胞衰退。因此，咱们念念知说念METTL3疏浚的胆固醇生物合成是否调整了NAFLD-HCC中CD8 T细胞的功能。咱们从荷瘤小鼠等分离T细胞，并在条款培养基中从小鼠Hepa1-6细胞中培养T细胞，不管是否敲除METTL3(图6A)。咱们发现，与空缺培养基比较，对照Hepa1-6的条款培养基显贵削弱了CD8 T细胞的反映，如IFN-g和颗粒酶B的抒发缩短(图6B)。值得看重的是，与对照组比较，来自METTL3敲除细胞的条款培养液在很猛进程上从头激活了CD8 T细胞(图6B)。更要紧的是，在东说念主NAFLD-HCC细胞(HKCI2)中敲除METTL3的条款培养液大略增强东说念主CD8 T细胞的抗肿瘤反映(图6C)。外源添加胆固醇和胆甾醇酯可扼制shMETTL3疏浚的CD8 T细胞活化(图6D)。相悖，在HKCI10中过抒发METTL3可扼制CD8 T细胞中IFN-g 和颗粒酶B ，这一作用被β-环糊精的胆固醇遮挡所逆转(图6E)。通过下调低密度脂卵白受体(LDLR)扼制T细胞胆固醇接管，可撤销体外METTL3过抒发介导的免疫扼制效应(图S6A和S6B)。为了考据胆固醇在METTL3疏浚的NAFLD-HCC中的作用，咱们用辛伐他汀(一种胆固醇生物合成扼制剂)调养过抒发METTL3的原位NAFLD-HCC。辛伐他汀显贵撤销了METTL3的促肿瘤作用(图S6C，S6D)。流式细胞术披露，辛伐他汀可激活过抒发METTL3的NAFLD-HCC移植体中IFN-g 和GZMB CD8 T细胞(图S6E)。因此，扼制胆固醇可减轻METTL3疏浚的小鼠免疫扼制和肿瘤滋长。T细胞杀伤检会也阐发了这些收尾，从NAFLD-HCC中赢得的CD8 T细胞具有肿瘤细胞杀伤智商(图6F、6G和S6F)，这一智商被补充胆固醇以剂量依赖的方式扼制(图6G)。这些发现强调了胆固醇在METTL3疏浚的NAFLD-HCC中抗肿瘤CD8 T细胞失活中的作用。鉴于SCAP是驱动胆固醇生物合成的下贱因子，咱们筹商SCAP是否参与了METTL3对CD8 T细胞功能的扼制作用。与咱们的假定一致，在过抒发METTL3的HKCI2(图6H)和HKCI10(图6I)细胞中，敲除SCAP (siSCAP)可使CD8 T细胞功能复原，与胆固醇水平缩短一致(图5R)。因此，咱们汇报了METTL3 - m6A - SCAP -胆固醇轴，该轴可在NAFLD-HCC中起义CD8 T细胞功能，促进肿瘤发生。图片
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图6. Mettl3介导的SCAP通过胆固醇积存损害CD8 T细胞功能。
(A) T细胞与肿瘤细胞条款培养基共培养的筹备。体外用CD3/CD28珠在白细胞介素(IL)-2存鄙人(10 ng/mL)刺激Naive T细胞。72 h后接收流式细胞术检测CD8 T细胞、IFN-g和GZMB的抒发。
(B)荷瘤小鼠脾脏分离的Naive T细胞与Hepa1-6细胞条款培养液共培养72h，并接收流式细胞术检测CD8 T细胞功能记号物。
(C)将东说念主CD8 T细胞与含或不含METTL3缺失的HKCI2细胞条款培养液共培养72 h，接收流式细胞术检测CD8 T细胞功能记号物。
(D)东说念主CD8 T细胞与经或不经METTL3敲除的HKCI2细胞条款培养液共培养72小时。如所示，加入胆固醇(0.2 mg/mL)或胆固醇酯(0.1 mg/mL)。流式细胞术检测各组IFN-g 、GZMB CD8 T细胞。
(E)东说念主CD8 T细胞与过抒发METTL3或不抒发METTL3的HKCI10细胞的条款培养液共培养72 h，按领导添加b-环糊精(b-CD, 0.5 mM)。流式细胞术检测各组IFN-g 、GZMB CD8 T细胞。
(F) T细胞介导的肿瘤杀伤实验。从Hepa1-6原位NASH肝脏分离的T细胞与贴壁肿瘤细胞(Hepa1-6)在指令胆固醇存鄙人共培养48小时，其余肿瘤细胞接收MTT法测定。MTT, 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴曲唑。
(G)肿瘤细胞杀伤百分率的统计图(F)。T细胞在呈现高胆固醇时杀伤的肿瘤细胞彰着少于对照组。
(H)将东说念主CD8 T细胞与过抒发mettl3的HKCI2细胞的条款培养液共培养72 H，用流式细胞术分析CD8 T细胞功能记号物。
(I)将东说念主CD8 T细胞与过抒发mettl3的HKCI10细胞的条款培养液共培养72 h，用流式细胞术分析CD8 T细胞功能记号物。
(S)Western思绪阐发T47 D-gMBOAT 1细胞中的MBOAT 1敲除。
8.靶向METTL3与抗PD-1调养协同扼制NAFLD-HCC。
由于METTL3在NAFLD-HCC微环境中失活CD8 T细胞，这促使咱们探索靶向METTL3是否能陶冶NAFLD-HCC的调养成果。将含或不含METTL3敲除的Hepa1-6-Luc细胞打针到C57BL/6J小鼠NASH肝脏中，然后赐与抗PD-1或IgG同型调养，建筑非基因型原位NAFLD-HCC模子(图7A)。值得看重的是，与对照组(p = 0.008)、sgMETTL3组(p = 0.032)和抗PD-1组(p = 0.008)比较，METTL3 抗PD-1组(p = 0.008)阐扬出协同扼制肿瘤滋长的作用(图7B和7C)，使肿瘤体积和分量减少>90%。此外，在抗PD-1调养的sgMETTL3肿瘤中，IFN-g 和GZMB CD8 T细胞浸润率最高(图7D)。在使用RIL-175细胞的第二个原位NAFLD-HCC小鼠模子中，进一步考据了METTL3敲除加抗PD-1调养的协同抗肿瘤作用(图S4A-S4C)。这些收尾标明，靶向METTL3可增强抗PD-1调养对NAFLD-HCC的扼制作用。
接下来，咱们研究了抗METTL3调养在强化抗PD-1调养NAFLD-HCC中的灵验性。领先，咱们讹诈基于纳米颗粒的小阻挠RNA (siRNA)方法来靶向METTL3。用2’-O甲基化修饰siRNA中的嘧啶基(C/U)以确保RNA的踏实性，并加入cyanine 5荧光符号来监测siRNA在体内的传递(图7E和7F)。在体外考据METTL3-siRNA的灵验性(图S7D)。咱们使用Hepa1-6-Luc细胞建筑了原位NAFLD-HCC，并通过荧光素酶成像监测肿瘤滋长。肿瘤造成后(第9天)，小鼠随即接受纳米粒子- sinc或纳米粒子- siMETTL3调养，加或不加抗PD-1调养(图7F)。如预期的那样，靶向METTL3 anti-PD-1在体内对肿瘤滋长的扼制作用最强(图7G和7H)，同期肿瘤内IFN-g 和GZMB CD8 T细胞水平最高(图7I)。临了，咱们算计了药物禁闭是否能灵验增强NAFLD-HCC患者的抗PD-1调养。STM2457是一种高效、遴选性的METTL3扼制剂咱们用STM2457、anti-PD-1或两者鸠合调养原位NAFLD-HCC (Hepa1-6)(图7J)。单独使用STM2457可显贵扼制肿瘤滋长(p < 0.05)，而抗PD-1则无作用。要紧的是，与对照组或单独调养比较，STM2457和抗PD-1鸠合调养对肿瘤滋长具有协同作用(p < 0.05)(图7K和7L)。此外，STM2457鸠合抗PD-1调养在NAFLD-HCC肿瘤中疏浚IFN-g 和GZMB CD8 T细胞的作用最强(图7M)。总之，靶向METTL3鸠合抗PD-1有望灵验调养NAFLD-HCC。
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图7. 靶向METTL3逆转NAFLD-HCC患者对免疫调养的耐药性。
(A)原位NAFLD-HCC模子和抗PD-1调养的实验筹备。用Hepa1-6-sgNC或Hepa1-6sgMETTL3细胞接种C57BL/6J小鼠，再用抗PD-1或IgG对照。
(B)小鼠肝脏生物发光成像及代表性图像。
(C)极度肿瘤分量和体积(n = 4-5 /组)。
(D)肿瘤浸润IFN-g 和GZMB CD8 T细胞的定量。
(E)使用基于PRG-PLGA的纳米颗粒(囊泡状纳米颗粒[VNP]-siRNA)在体内的siRNA暗意图。聚乙二醇-聚乳酸-酒精酸。
(F) VNP-siRNA和抗PD-1调养原位NAFLD-HCC的实验筹备。接种Hepa1-6细胞的C57BL/6J小鼠分辨用VNP-siMETTL3、抗PD-1或它们鸠合处理。
(G)小鼠肝脏生物发光成像及代表性图像。
(H)极度肿瘤分量和体积(n = 6-9 /组)。
(1)肿瘤浸润IFN-g 和GZMB CD8 T细胞的定量。
(J) STM2457鸠合抗PD-1调养原位NAFLD-HCC的实验筹备。接种Hepa1-6细胞的C57BL/6J小鼠分辨用STM2457、抗PD-1或两者鸠合处理。
(K)肝脏生物发光成像及代表性图像。
(L)极度肿瘤分量和体积(n = 10/组)。
(M)肿瘤浸润IFN-g 和GZMB CD8 T细胞的定量。
文件追溯
NAFLD是HCC的一个危急要素。这项算计发现METTL3是导致NAFLD-HCC的一个要紧因子， METTL3通过调控SCAP mRNA抒发，促进胆固醇合成，扼制CD8 T细胞，从而促进NAFLD-HCC的发展。这项算计标明METTL3加抗PD-1联用可能是一种灵验扼制NAFLD-HCC的调养组合。
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DOI：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2023.101144
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END撰文 | Xiao Hai Tao
校对 | Xiao Hai Tao
剪辑 | Liu Meng Xiang
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