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Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋一火是最常用的检测细胞凋一火的步骤之一。在细胞启动早期凋一火时， 磷脂腺丝氨酸会外翻到细胞名义，即细胞膜外侧。举例，用绿色荧光探针 YF488 秀美的 Annexin V，它不错归拢外翻的磷酯酰丝氨酸，从而检测细胞凋一火的垂死特征。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种 DNA 归拢染料，它不错染色坏死细胞或凋一火晚期丧失细胞膜完整性的细胞的细胞核。 PI 不错由 488,532 或 546 nm 的激光引发，呈现红色荧光。因此将 YF 488-Annexin V 与PI匹配使用，就可差别活细胞、早晚期凋一火细胞和死细胞。
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YF488 染料与传统 FITC 比较，荧光亮度更高，且不受环境中 pH 的影响，具有细致的光沉着性。一、操作智商（贴壁细胞为例）1.1 对看管的建筑
1）空缺管：教学凋一火的细胞不加染料，用来更正电压；
2）单染管：分别需要只加 PI 和荧光秀美的 Annexin V 两个单染管，用来更正抵偿；
3）履行管：教学凋一火的细胞加本次履行的通盘荧光染料；
4）阴性管：平方培养细胞加入染料，证据细胞平方情景，排斥假阳性1.2 细胞管制及染色
1）取对数孕育期细胞接种于 6 孔板或 6cm 培养皿（用什么培养皿取决于所培养的细胞，保证最终蚁合的细胞数大于 5×105 个）；
2）笔据履行需要管制细胞。蚁合细胞时将培养液吸至离心管内，PBS 洗涤细胞一次，用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，并蚁合于离心管中（悬浮细胞可平直离心蚁合）；注：用胰卵白酶消化然后使细胞在最好细胞培养条目和培养基中归附约 30 分钟，然后再染色。 胰卵白酶消化会暂时碎裂质膜，允许Annexin V归拢磷脂酰丝氨酸在细胞膜的细胞质名义上，从而导致假阳性染色。
3）将蚁合的培养基和细胞混匀，4℃ 300g 离心 5min，弃上清。用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，每次 4℃ 300g 离心 5min；
4）加入 1× Binding Buffer，将细胞更正成疏导浓度（一般为 1×106/mL）；
5）取 1-2×105 个细胞悬液于流式管中，加入适量秀美了荧光染料的 Annexin V 和适量 PI，轻轻混匀；
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6）室温避光孵育 15-20 min；
7）加入 300 μl PBS 重悬细胞，尽快（1 小时内）用流式细胞仪检测。PS：对看管建筑尤其垂死
二、履行终局图
2.1 YF488-Annexin V 荧皎洁微镜履行终局
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2.2 YF488 -Annexin V 流式履行终局图
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YF 488-Annexin V 与 PI 双染试剂盒能够无缺的差别活细胞，早期凋一火细胞及晚期凋一火细胞/坏死细胞。
三、常见问题3.1 各象限代表的细胞情景问题
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Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋一火细胞在其中，甚而机械损害的细胞也包含其中。AnnexinV-/PI+越多，履行终局越不信得过，提倡履行中尽量限度这一象限细胞比例。Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋一火细胞。Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此区域的细胞为早期凋一火细胞。Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。3.2 抵偿更正问题
小程序开发1）不同的染料组合，抵偿大小不同。
2）电压对抵偿的影响不小，电压变抵偿变，是以咱们要先更正FSC、SSC和荧光通谈的电压，电压调好之后再调抵偿。
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3）细胞亦然影响抵偿大小的一个身分，如淋巴细胞和肿瘤细胞之间、活细胞与固定后细胞之间，秀美疏导的荧光素偶联抗体，使用疏导的通谈时，各通谈之间的抵偿可能不同。是以当细胞理化性质互异较大时，最好再行更正新的样品细胞的抵偿，确保得到准确的流式终局。3.3 对于假阳性问题
1）对贴壁细胞而言，消化是最要道的智商，消化液需用不含 EDTA 的胰酶，因为 Annexin V 和 PS 的归拢需要 Ca2+，而 EDTA 是 Ca2+ 螯合剂，使用含有 EDTA 的胰酶会变成假阴性。其次消化技艺不宜过长，奏乐细胞要柔软，因为胰酶的过度消化和机械损害王人会引起细胞膜的损害，变成假阳性。细胞消化下来后，提倡在培养箱中在孵育 30min，联系我们使细胞膜归附完整性，幸免假阳性，或者将细胞报讯在含 2% BSA 的 PBS 中，防卫进一步的损害。
2）神经细胞膜容易碎裂外翻，导致假阳性，是以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋一火不适用于神经细胞。3.4 对于荧光染料遴荐的问题
1）对于荧光染料的遴荐，提倡要是流式细胞仪带有 488 nm 和 633 nm 两个或以上激光管，领先洽商用 APC 或 YF647 秀美 Annexin V，因为它和 PI 通谈着实无须洽商光肖似问题，不错减少更正抵偿的郁闷，要是独一 488 nm 激光管则可遴荐YF488/FITC 秀美的 Annexin V。2）再次需要洽商细胞是否自带荧光，因为感染病毒或质粒转染的细胞往往带 GFP 荧光，GFP 与 YF488/FITC 通谈肖似，不成遴荐 YF488/FITC 秀美的 Annexin V，此时要是独一 488 nm 一根激光管不错用 PE 秀美 Annexin V，用 7-AAD 代替 PI，或者改用 YF647 Annexin V 代替 YF488。3）终末还要洽商管制身分是否带有荧光，本履行室就遭遇过一个促凋一炸药物 Doxorubicin 本人发红色荧光，对 PI 通谈的检测变成严重烦嚣，而且浓度越大烦嚣越显著。这时提倡选定其他检测步骤。3.5 设门问题1）要终点小心在FSC/SSC圈门时，所选细胞界限会对终局变成较大影响，是以在分析数据时，要把通盘细胞王人圈进FSC/SSC的门内，这么履行终局才会更信得过。如图，使细胞群大致位于对角线上，何况细胞群较蚁集，群内细胞比例要在80%以上，要是细胞全部圈入，细胞比例才50%或者更低，评释细胞被压在了坐标轴上，这时要再行更正FSC和SSC。图片
2）贴壁细胞作念Annexin V凋一火检测，凡俗分群不太划定，这时咱们不错笔据不加药细胞来画不划定的十字门。如底下图形的设门姿色。图片
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3.6 免疫染色与凋一火染色递次问题Annexin V凋一火染色不错和抗体全部对细胞进行染色吗？不错，但提倡Annexin V和其它抗体分开染色。举例Annexin V、PI和CD3、CD8同期秀美淋巴细胞，不错先在PBS中秀美CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含钙离子）中秀美Annexin V。3.7 其他问题1）液氮保存的组织块，不提倡再作念流式细胞分析。因为流式细胞分析要求细胞漫步、单个，活性好，组织在冻存、复温的进程中会有大王人的细胞牺牲，同期经过这一进程的组织在分离成单个细胞的时候会形成好多细胞碎屑，不宜崇高式检测，是以用于流式检测的标本最好是簇新标本，即取材后立即检测，终局最好。液氮保存的组织块，不错将组织标本进行切片，然后作念原位染色，不雅察组织细胞的凋一火。
2） Annexin V也不错用在植物和细菌中检测凋一火，具体履行智商可参考相干文件。
3）要是样品开始于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V归拢，烦嚣履行终局。
4）操作中务必算作柔软，离心后证据管底是否有细胞，凡俗有东谈主液体一甩，细胞也给甩走了。操作中还要小心避光。
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